1实验仪器与材料:

二甲基甲酰胺（DMF），哌啶，树脂，二氯甲烷（DCM），茚三酮反应试剂（茚三酮，维C，苯酚），四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），六氢吡啶（哌啶），三异丙基硅烷TIS,乙二硫醇（EDT），无水乙醚，三氟乙酸（TFA），N-甲基吗啉（NMM），甲醇，各种氨基酸,Fmoc-e-Acp-OH,FITC，多肽固相合成管。

2溶液配制：

脱保护溶剂——六氢吡啶：DMF=1：4

反应液——NMM:DMF=1：24

裂解液——TFA(92.5%)TIS(2.5%)EDT(2.5%)

茚三酮测试液——茚三酮、vc、苯酚各一滴

荧光偶联溶剂——吡啶：DMF：DCM=12:7:5

3荧光标记多肽实验步骤:

（1）称量树脂并投入到多肽固相合成管（以下简称反应器）中，加入适量的DMF溶胀半小时以上。抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，10min于摇床。

（2）抽掉去保护液，用DMF、 DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂（约5~10mg）于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。

（3）分别按照SEQ.1- SEQ.N肽的氨基酸序列顺序取相应氨基酸、HBTU（氨基酸：HBTU=1:1），用反应液溶解，投入到反应器中，搅拌反应。1-2小时后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。

（4）抽掉反应器中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到氨基酸缩合后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应步骤，至氨基酸反应完毕。

（5）反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂2-3次，甲醇洗两次，继续抽干15-20min。反应器中取出合成完的肽树脂，在室温下于裂解液（裂解液先冰浴20min）中裂解两小时。将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，用无水乙醚（冰浴）洗3次。

（6）粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90%。所得到的纯肽使用质谱(MS, electrospray)鉴定。

（7）至肽合成后，取出部分加荧光标记。先将Fmoc-e-Acp-OH按氨基酸偶联方法链接在多肽上，再取适量HBTU与FITC溶于荧光偶联溶剂中，1——2天后，茚三酮测试液测试。如果未偶联上，相同方法在重复一次。