发明领域

本发明涉及大环氮杂吡啶环蕃(macroazapyridinophane)的金属复合物及其组合物，它们用于治疗和预防与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

发明背景

溶酶体(lysosome)和蛋白酶体(proteasome)是清除细胞内沉积物蓄积的两种主要细胞途径。溶酶体在称为自噬(autophagy)的过程中分解通过内吞作用(endocytosis)进入细胞的蛋白质、核酸或脂质方面是至关重要的，而蛋白酶体主要负责真核生物中的细胞内蛋白质。

自噬是用于回收废弃细胞成分并且清除受损细胞器(organelles)和蛋白质聚集体的溶酶体降解过程。自噬过程包括多个步骤：在诱导自噬之后，通过双层膜捕获细胞质的部分(可以包括全部细胞器(organules))，形成自噬体(autophagosome)。之后，自噬体与内体(endosome)和溶酶体融合，形成自溶酶体(autolysosome)。然后进行细胞器和大分子的完全消化。主要通过两种蛋白质缀合体系控制自噬体膜的伸长。一种体系意味着atg12和atg5的缀合，而另一种体系意味着lc3的细胞溶质形式(称为lc3-i)向脂质形式(称为lc3-ii)的转化，这与自噬体膜有关。lc3-ii蛋白的水平目前是***为人接受和使用的自噬活性的生物标记物。

另一方面，几项研究已经证实在衰老期间蛋白质稳态崩溃，导致未折叠的、错误折叠的或聚集的蛋白质的蓄积，这导致许多年龄相关性疾病。用于维持蛋白质组的主要机制之一是蛋白酶体系统，其保证移除受损或错误折叠的蛋白质，并且因此在延缓衰老方面起到核心作用。

***后，若干疾病呈现出在自噬和蛋白酶体活性方面的缺陷，导致细胞蓄积蛋白质、脂质或其他分子。事实上，神经元是特别容易被受损的自噬或蛋白酶体活性影响的细胞。例如，在哺乳动物中广泛表达突变的亨廷顿蛋白(huntingtin)，其是导致亨廷顿病(huntington’sdisease)的蛋白质。然而，在这种分子崩溃为聚集体并且在神经元细胞核中和周围蓄积之后，仅神经系统遭受大幅损害。各种其他组织和细胞类型仍然明显不受影响。因此，呈现出蛋白质沉积或蓄积的疾病明显具有通过自噬或蛋白酶体活性清除那些内部沉积物的细胞问题。

因此，需要治疗呈现出细胞内沉积物蓄积的疾病，其中所述蓄积归因于导致那些沉积物的异常蓄积的代谢缺陷并且其中正常的细胞自噬或蛋白酶体活性不能将它们移除，或者治疗其中所述蓄积归因于缺陷型自噬或蛋白酶体活性的疾病。

授权专利ep2492270和us9145386涉及包含以下描述为a或b的化合物的金属复合物。所述化合物包含大环多氮杂吡啶环蕃中心结构，其中喹诺酮杂环附着至所述中心结构，并且其中所述喹诺酮杂环通过4位与亚甲基基团(或桥)键合，所述亚甲基基团(或桥)进而与连接至所述三氮杂吡啶环蕃中心结构的乙胺链的-nh基团键合(作为以下a示出)，或者备选地，其中所述喹诺酮杂环通过2位与亚甲基基团键合，所述亚甲基基团进而与连接至所述三氮杂吡啶环蕃中心结构的乙胺链的-nh基团键合(作为以下b示出)。

根据所引用的专利，包含以上作为a或b示出的化合物的所述金属复合物家族可用于治疗性地治疗“其病因根源在于内源sod的活性紊乱或缺乏”的疾病(参见ep2492270[0001])。

发明简述

本发明涉及一种金属复合物，所述金属复合物包含通式(i)的化合物

和至少一个金属离子，所述金属复合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

因此，在本文中公开的金属复合物的特征为通过喹诺酮部分的4位连接的三氮杂吡啶环蕃中心。

在本说明书中公开的实验数据仅涉及所述金属复合物家族的选择，其中作为在所述金属复合物家族中的特征的喹诺酮杂环通过4位与三氮杂吡啶环蕃中心结构键合(作为a示出)。

所公开的一个实施方案涉及在本文中以上所述的金属复合物，其用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述金属离子是二价金属离子。

所公开的另一个实施方案涉及在本文中以上所述的金属复合物，其用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述二价金属离子可以独立地选自cu(ii)、fe(ii)、zn(ii)或mn(ii)。

用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病的以上公开的金属复合物的另一个实施方案是包含式(i)的化合物和mn(ii)的金属复合物(ii)。

所公开的实验数据显示，仅对于在上述专利文献(ep2492270、us9145386和wo2015124824a1)中公开的三氮杂吡啶环蕃金属复合物家族的特定选择存在自噬和/或蛋白酶体活性的激活。事实上，本发明涉及金属复合物的特定选择，其中喹诺酮部分通过4位与三氮杂吡啶环蕃中心结构连接，其用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

另外，本发明的一个实施方案涉及组合物，所述组合物包含有效量的金属复合物连同至少一种赋形剂或载体，所述金属复合物包含如在本文中以上所述的通式(i)的化合物和至少一个金属离子；所述组合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。优选地，所述金属离子是二价金属离子，更优选地，所述二价金属离子可以独立地选自cu(ii)、fe(ii)、zn(ii)或mn(ii)，并且甚至更优选mn(ii)。

附图简述

图1a和1b：在存在或不存在金属复合物(ii)的情况下在人成纤维细胞上的lc3-ii的水平。图1a示出了金属复合物(ii)对在完全和禁食培养基(krebs-henseleit)中的对照细胞系(c1和c2)和拉福拉病(lafora)患者细胞系(l1、l2和m1)的lc3-ii水平的影响。图1b示出了金属复合物(ii)对在完全和禁食培养基中的对照细胞系(c1和c2)以及l3和m1拉福拉细胞系的lc3-ii水平的影响。图1c示出了在不存在或存在5μm的金属复合物(ii)的情况下在6小时期间测试的用荧光gfp-lc3转染的来自拉福拉病患者的人成纤维细胞(作为l-3示出)和健康人成纤维细胞(作为c-1示出)。可见点示出了自噬泡(autophagicvacuole)。在图底部的白线用于参考并且表示10μm。

图2：在不存在(标记为1)或存在1μm、5μm和10μm浓度(分别标记为2、3和4)的金属复合物(ii)的情况下测试的在健康人成纤维细胞(细胞系3349b和3348d)或具有在laforin(针对在3349b上的laforin突变的l1和针对在3348d上的laforin突变的l2)和malin(针对在3349b上的malin突变的m1)中的突变的人成纤维细胞上的lc3-ii的水平。使用雷帕霉素(rapamycin)作为阳性对照(标记为5)。标记5*是负载误差。

图3：示出了在人真皮成纤维细胞中使用金属复合物(ii)的蛋白酶体糜蛋白酶样激活的体外研究。以相对于对照标准化的相对发光单位(relativeluminescenceunit，rlu)测量结果。图3b示出了相对于未处理的细胞的对照使用5μm的金属复合物(ii)进行的测试，并且图3a示出了相对于未处理的细胞的对照使用也为5μm的pytren2q进行的测试。与金属复合物(ii)一样，pytren2q也是包含三氮杂吡啶环蕃中心结构的mn(ii)复合物，但是其中喹诺酮杂环通过2位与所述三氮杂吡啶环蕃中心结构连接。因此，在pytren2q中的喹诺酮杂环通过2位与三氮杂吡啶环蕃中心结构连接，而不是如在本文中公开的金属复合物通过4位与三氮杂吡啶环蕃中心结构连接。

图4：模型蠕虫秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)(c.elegans)和测试轻微触摸敏感性(gentletouchsensitivity)的仪器(胶粘至牙签末端的眉毛)的图示。

图5a示出了显示在flp机械感觉神经元(圆圈示出)中的110q::tdtomato表达的转基因蠕虫(秀丽隐杆线虫)的头部的共聚焦图像。淡灰色的组织是针对转基因的标记物(即在咽部中表达的绿色荧光蛋白(gfp))。图5b示出了显示表达110q::tdtomato聚集体(圆圈示出)的flp神经元的共聚焦图像。图5c示出了对表达显示出神经元损害(比野生型动物更低的机械感受)的110q::tdtomato的三个独立品系进行的触摸测定。图5d示出了金属复合物(ii)如何能够以剂量依赖性方式挽救归因于110q::tdtomato表达的神经元损害。使用未处理的动物(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)进行测试作为对照c。在图5c和5d中的结果作为显示出触摸响应的个体的％给出。使用二甲双胍(metf)作为阳性对照。

图6示出了由图5d表示的三个重复测试的结果，其中在秀丽隐杆线虫的亨廷顿病模型中在不同浓度下在轻微触摸敏感性方面对金属复合物(ii)进行测试。使用未处理的动物(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)进行测试作为对照c。结果作为显示出触摸响应的个体的％给出。使用二甲双胍(metf)作为阳性对照。

图7示出了相对于在测试剂量中不产生任何显著变化的化合物2q，金属复合物(ii)如何能够以剂量依赖性方式挽救归因于110q::tdtomato表达的神经元损害。使用未处理的动物(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)进行测试作为对照c。使用二甲双胍作为阳性对照。结果作为显示出触摸响应运动的个体的％给出。

图8示出了与作为对照的未处理的动物(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)(左侧第1柱)相比，金属复合物(ii)如何能够挽救归因于110q::tdtomato表达的神经元损害(左侧第3柱)。结果作为显示出触摸响应的个体的％给出。然而，当将特定的自噬抑制剂如氯喹与金属复合物(ii)组合使用时，没有检测到挽救(左侧第4柱)。氯喹不引起相对于归因于110q::tdtomato表达的触摸响应损害(左侧第1柱)的额外的触摸响应损害(左侧第2柱)。

发明详述

因此，本发明涉及一种金属复合物，所述金属复合物包含通式(i)的化合物

和至少一个金属离子，所述金属复合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

如在本文中所描述的，金属复合物是指化合物与至少一个金属离子的分子缔合，特别是指通式(i)的化合物与至少一个金属离子的分子缔合。

本发明的一个实施方案涉及包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，所述金属复合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述金属离子是二价金属离子。

本发明的另一个实施方案涉及包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，所述金属复合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述二价金属离子独立地选自cu(ii)、fe(ii)、zn(ii)或mn(ii)。

在本发明的另一个实施方案中，金属复合物是包含式(i)的化合物和mn(ii)的金属复合物(ii)。

在本发明的上下文中，与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病是指，但不限于，亨廷顿病(huntingtondisease)、朊病毒病(priondisease)、局灶性节段性肾小球硬化症(focalsegmentalglomerulosclerosis)、与aat缺乏(α-1抗胰蛋白酶缺乏)相关的疾病、神经鞘脂贮积症(sphingolipidoses)、c型尼曼-皮克病(niemann-picktypecdisease，npc)、沃尔曼病(wolmandisease)和胆固醇酯贮积病(cholesterylesterstoragediseases，cesd)、糖原贮积病(glycogenstoragediseases)、半乳糖血症(galactosemia)、遗传性果糖不耐受症(hereditaryfructoseintolerance)、黏多糖贮积症(muccopolysaccharidoses)、丙酮酸盐代谢病症、磷酸甘油酸激酶缺乏症(phospohoglyceratekinasedeficiency)、拉福拉病(laforadisease)、肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)、自噬性空泡性肌病(autophagicvacuolarmyopathies)、danon病、脑海绵状畸形(cerebralcavernousmalformation，ccm)、2型颗粒状角膜营养不良(granularcornealdystrophytype2，gcd2)、慢性肾病(chronickidneydisease，ckd)、遗传性肌病(inheritedmusclediseases)如bethlem肌病、ullrich先天性肌营养不良(congenitalmusculardystrophy)和肌硬化症(myosclerosis)、包涵体肌炎(inclusionbodymyositis)；病毒感染如hiv、腺病毒(adenovirus)、乙型肝炎(hepatitisb)或htlv；干燥综合征(sjogren'ssyndrome)；脓毒症(sepsis)或代谢性酸中毒(metabolicacidosis)。

特别地，本发明的一个实施方案涉及包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，根据本发明，所述金属复合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积和/或缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述疾病独立地选自亨廷顿病、朊病毒病、白内障(cataracts)、局灶性节段性肾小球硬化症、与aat缺乏相关的疾病、神经鞘脂贮积症、c型尼曼-皮克病(npc)、沃尔曼病和胆固醇酯贮积病(cesd)、糖原贮积病、半乳糖血症、遗传性果糖不耐受症、黏多糖贮积症、丙酮酸盐代谢病症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、拉福拉病、肾上腺脑白质营养不良、自噬性空泡性肌病、danon病、脑海绵状畸形(ccm)、2型颗粒状角膜营养不良(gcd2)、慢性肾病(ckd)、bethlem肌病、ullrich先天性肌营养不良、肌硬化症、包涵体肌炎、hiv、腺病毒、乙型肝炎、htlv；干燥综合征、脓毒症或代谢性酸中毒。优选地，所述疾病独立地选自拉福拉病、肾上腺脑白质营养不良或亨廷顿病。更优选地，所述疾病是拉福拉病或亨廷顿病。

在呈现出缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性的细胞中，在本文中公开的包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物刺激或激活自噬和蛋白酶体活性。在本文中公开的金属复合物还能够减轻呈现出缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性的疾病的症状。

本发明的一个实施方案涉及在本文中以上所述的包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，所述金属复合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述疾病是年龄相关性疾病。

对于本说明书的目的来说，年龄相关性疾病是与增加的衰老相关的疾病，所述衰老进而与细胞衰老和细胞损伤的蓄积相关，特别是细胞内沉积物的蓄积，所述细胞内沉积物是脂质、碳水化合物或蛋白质沉积物。

在本公开的上下文中，进而与脂质、碳水化合物或蛋白质沉积物的蓄积相关的所述年龄相关性疾病是指，但不限于，与aat缺乏(α-1抗胰蛋白酶缺乏)相关的疾病、亨廷顿病、朊病毒病、局灶性节段性肾小球硬化症、神经鞘脂贮积症、c型尼曼-皮克病(npc)、沃尔曼病和胆固醇酯贮积病(cesd)、糖原贮积病、半乳糖血症、遗传性果糖不耐受症、黏多糖贮积症、丙酮酸盐代谢病症或磷酸甘油酸激酶缺乏症。

本发明的另一个实施方案涉及在本文中以上所述的包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，所述金属复合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述疾病独立地选自拉福拉病或亨廷顿病。

本发明的一个实施方案涉及在本文中以上所述的包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，所述金属复合物用于治疗呈现出细胞内沉积物蓄积的疾病。在优选的实施方案中，所述疾病选自拉福拉病、肾上腺脑白质营养不良或亨廷顿病，更优选拉福拉病或亨廷顿病。

拉福拉病，也称为拉福拉进行性肌阵挛性癫痫(laforaprogressivemyoclonicepilepsy)或melf，是常染色体隐性遗传病，其特征为在心脏、肝脏、肌肉和皮肤的细胞的细胞质内存在包涵体(拉福拉体)。拉福拉病患者呈现出在laforin或malin蛋白中的突变。

在本文中公开的包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物激活呈现出缺陷自噬的在laforin和malin蛋白中具有突变的拉福拉病患者细胞中的自噬，如在实施例1(图1和2)中所示。事实上，在实施例1中，对来自健康个体的成纤维细胞和来自拉福拉病患者的成纤维细胞进行测试。结果显示，在用金属复合物(ii)处理之后所有成纤维细胞均具有更高的lc3-ii蛋白水平，其中lc3-ii的量表示自噬激活的水平(图1和2)。

使用完全培养基并且使用禁食培养基进行***次测试。将营养物质从培养基中部分移除模仿了细胞禁食状态(禁食培养基)并且引起细胞激活自噬以从降解内部结构获得能量。

在图1a、图1b中示出了在拉福拉病患者中存在的缺陷自噬，其中具有在laforin和malin中的突变的未处理的细胞系(l1、l2、l3或m1)在完全和禁食培养基二者中均显示出比未处理的对照细胞系(c1和c2)更低的lc3-ii水平。

对照成纤维细胞和来自拉福拉病患者的成纤维细胞二者(图1a和1b)在用浓度为5μm的金属复合物(ii)在6小时期间处理之后具有更高的lc3-ii蛋白水平。

在禁食培养基中并且在不存在金属复合物(ii)的情况下，当与用相同细胞在完全培养基中完成的测试相比时，看到蛋白lc3-ii的水平的增加，确认了在不存在营养物质的情况下自噬增加。参照未处理的细胞，用金属复合物(ii)处理甚至进一步增加了lc3-ii的水平，确认了在用金属复合物(ii)处理的细胞中的自噬水平的增加。

进行另一项研究，在1、5和10μm浓度下测试金属复合物(ii)。在不存在(标记为1)或存在1μm、5μm和10μm浓度(分别标记为2、3和4)的金属复合物(ii)的情况下测试在健康人成纤维细胞上的lc3-ii的水平或在具有在laforin和malin中的突变的人成纤维细胞中的lc3-ii的水平。使用雷帕霉素(rapamycin)作为阳性对照(标记为5)。再次地，在本研究中，在将健康未处理细胞中的lc3-ii水平与未处理的拉福拉细胞比较的图2中，也看到了在拉福拉病患者中存在的缺陷自噬。测试的结果在图2中示出，其中当加入至培养基中时，金属复合物(ii)增加了自噬，在正常人成纤维细胞以及在laforin或malin中具有缺陷的成纤维细胞上显示出更高的lc3-ii蛋白水平。

考虑到lc3-ii的量表示自噬激活的水平，所述数据表明金属复合物(ii)刺激或激活在健康细胞中和在自噬缺陷细胞中的自噬。

使用不同的实验研究在本文中公开的金属复合物对自噬的影响，完成使用用gfp-lc3转染的细胞的荧光测试(图1c)。在这个实验中，在不存在或存在金属复合物(ii)的情况下测试健康人成纤维细胞(对照c-1)和来自拉福拉病患者的成纤维细胞(l-3)。在图1c中示出的结果表明，在存在金属复合物(ii)的情况下增加了自噬(通过自噬泡的增加而测量)，这再次表明金属复合物(ii)刺激或激活自噬。

亨廷顿病由个体的称为亨廷顿(huntingtin)(htt)的基因的两个拷贝之一的常染色体显性突变引起。htt在人中的功能并不清楚。在编码亨廷顿蛋白的基因中的cag(胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤)三联体重复的扩张得到编码一长串谷氨酰胺的异常蛋白，其易于与本身和与其他蛋白质聚集。突变的亨廷顿蛋白(mhtt)的这种“粘性”状况干扰许多重要的神经元事件(例如突触传递、轴突运输、转录等)并且通过不完全了解的机制逐渐损害脑中的细胞。因此，这种疾病由mhtt蛋白在神经元中的蓄积引起。通过使用在本文中公开的金属复合物的蛋白酶体和/或自噬激活来降解这些沉积物导致了如在实施例3中针对秀丽隐杆线虫的亨廷顿病模型所示的症状的衰退。

秀丽隐杆线虫利用神经元回路检测并且响应于多种机械刺激。这些刺激包括传递至身体的轻微触摸刺激、对身体中部(midbody)的严苛触摸、对头部或尾部的严苛触摸、鼻触摸和肌理(texture)。用于测试轻微触摸敏感性的***初且***常用的方法是用已经胶粘至牙签末端的眉毛轻触动物(图4)。

在实施例3中使用的秀丽隐杆线虫动物表达与机械感觉神经元中的红色荧光蛋白tdtomato的基因在框中融合的110cag(110q::tdtomato)，如在图5a和5b中所示。表达110q::tdtomato的动物相对于野生型动物(wt)呈现出神经元损害，如在图5c中所示，其中在使用表达110q::tdtomato的神经元损害的动物(三个不同品系)进行的测试中得到的显示出触摸响应的动物的％明显低于使用wt动物得到的显示出触摸响应的动物的％。

图5d(以及在图6中示出的所述测试的3个重复)显示出当与未处理的动物相比时，在用金属复合物(ii)处理的动物中以剂量依赖性方式显示出触摸响应的个体的％的显著提高。因此，结果表明，由金属复合物(ii)例示的本发明的金属复合物能够以剂量依赖性方式显著改善在表达110q::tdtomato的秀丽隐杆线虫亨廷顿病模型中所显示的症状。

与这种活性相反，图7并未显示出当与未处理的动物相比时在用2q处理的动物中的％触摸响应的显著提高，并且因此2q在任何测试剂量下均未显著改善在秀丽隐杆线虫亨廷顿病模型中的触摸响应。

2q和金属复合物(ii)之间的结构差异意外地导致由在本文中公开的特定金属复合物家族提供的蛋白酶体和/或自噬激活。如以上所述，在本文中公开的包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物的特征为喹诺酮部分通过4位与分子的三氮杂吡啶环蕃中心结构键合，而作为同样具有三氮杂吡啶环蕃中心结构特征的化合物的2q，其特征反而为所述喹诺酮部分通过2位连接。

以上所示的所有结果强烈支持金属复合物(ii)能够挽救由在神经元中的110q::tdtomato产生的毒性效应并且显著提高显示出触摸响应的动物的％。

还测试了这种神经元挽救效果是否具体通过自噬产生。这按照在实施例3中所解释的完成，其中在金属复合物(ii)和作为公知的自噬抑制剂的氯喹的存在下温育秀丽隐杆线虫蠕虫。如图8所示，在两种化合物的存在下培养的动物不再被挽救，表明金属复合物ii的有益效果归因于自噬。

本发明的另一个实施方案涉及在本文中以上所述的包含式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，所述金属复合物用于治疗与缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

实施例2示出了由金属复合物(ii)例示的本发明的化合物如何刺激蛋白酶体活性(图3b)。还在相同测试条件下测试了2q。图3a显示，与由金属复合物(ii)示出的活性相反，化合物2q不刺激蛋白酶体活性。

再次地，那些结果表明，2q和金属复合物(ii)之间的结构差异(其中喹诺酮杂环分别地通过2位而不是通过4位与三氮杂吡啶环蕃中心结构键合)意外地提供了具有蛋白酶体和/或自噬激活的在本文中公开的金属复合物的选择。

本发明的一个实施方案涉及一种组合物或药物组合物，所述组合物或药物组合物包含如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物；连同至少一种赋形剂或载体，所述组合物或药物组合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

对于本公开的目的来说，可接受的赋形剂或载体是水、盐水溶液、醇、聚乙二醇、聚羟基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄榄油、乳糖、白土(terraalba)、葡萄糖、果糖、甘露糖醇、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、明胶、琼脂、果胶、淀粉、阿拉伯树胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羟甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮等。

另一个实施方案公开了一种组合物，所述组合物包含有效量的如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，连同至少一种赋形剂或载体，所述组合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

通常，在治疗中采用有效量的目标化合物。根据本发明使用的化合物的剂量根据化合物和治疗条件(例如受试患者的年龄、体重和临床条件)变化。其他因素包括：施用途径、患者、患者的病史、疾病过程的严重性和特定化合物的效力。剂量应当足以改善所治疗的疾病的症状或征兆而不对患者产生不可接受的毒性。通常，有效量的化合物是这样的化合物，其提供了主观的症状缓和或如由临床医师或其他有资格的观察者指出的客观的可辨别的改善。

本发明的另一个实施方案涉及如在本文中以上所述的用于所述用途的组合物，所述组合物包含有效量的如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，连同至少一种赋形剂或载体，所述组合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述组合物还任选地包含至少一种第二活性化合物。

所述第二活性化合物相当于在治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病中使用的化合物，其包括，但不限于，二甲双胍、核酸、抗体、微小rna、抗氧化剂、多酚化合物、多巴胺能抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、利鲁唑、姜黄素和细胞疗法。

因此，本发明的一个实施方案涉及如在本文中以上所述的用于所述用途的组合物，其中所述第二活性成分独立地选自二甲双胍、核酸、抗体、微小rna、抗氧化剂、多酚化合物、多巴胺能抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、利鲁唑或姜黄素。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含有效量的如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，连同至少一种赋形剂或载体，其中所述金属离子是二价离子。更优选地，所述二价金属离子选自cu(ii)、fe(ii)、zn(ii)或mn(ii)。

本发明的另一个实施方案公开了一种组合物，所述组合物包含有效量的如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，以及至少一种赋形剂或载体，所述组合物用于如在本文中以上所述的用途，其中所述金属复合物是金属复合物(ii)。

本发明的另一个实施方案公开了如在本文中以上所述的组合物，其用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述疾病是年龄相关性疾病。

本发明的一个实施方案公开了如在本文中以上所述的组合物，所述组合物用于治疗呈现出细胞内沉积物蓄积的疾病。在优选的实施方案中，所述疾病选自拉福拉病、肾上腺脑白质营养不良或亨廷顿病，更优选拉福拉病或亨廷顿病。

本发明的另一个实施方案公开了一种组合物，所述组合物包含有效量的如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，连同至少一种赋形剂或载体，所述组合物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述疾病独立地选自拉福拉病或亨廷顿病。

一个实施方案公开了如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。优选地，所述金属离子是二价离子，更优选独立地选自cu(ii)、fe(ii)、zn(ii)或mn(ii)。

另一个实施方案公开了如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病，其中所述金属复合物是金属复合物(ii)。

所公开的发明的一个实施方案提供了一种治疗方法，所述方法包括向患有呈现出细胞内沉积物蓄积的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病的个体施用有效量的如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物。优选地，所述金属离子是二价离子，更优选独立地选自cu(ii)、fe(ii)、zn(ii)或mn(ii)。

所公开的一个实施方案提供了一种治疗方法，所述方法包括向患有与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病的个体施用有效量的如在本文中以上所述的包含通式(i)的化合物和至少一个金属离子的金属复合物，其中所述金属复合物是金属复合物(ii)。

实施例

实施例1：在拉福拉病中的自噬激活的研究

对来自健康个体的两个成纤维细胞系(对照，c1和c2)和来自拉福拉病患者的三个成纤维细胞系(l1和l2，在laforin中具有缺陷；m1，在malin中具有缺陷)进行测试。

所有细胞系均从centrodeinvestigaciónprincipefelipe(cipf)保藏中心获得。在laforin[aguado等，2010,humanmoleculargenetics19,2867-2876；knecht等，2010,autophagy,6,991-993]或malin[criado等，2012,hum.mol.genetics21,1521-1533；knecht等，2012,autophagy8,701-703]中具有缺陷的来自拉福拉病患者的所使用的所有细胞系均具有在自噬方面的不足。

1.1.lc3-ii水平的研究

如之前提及的，lc3-ii蛋白的水平目前是***佳的自噬活性的生物标记物。

如之前描述的[moruno-manchon等，biochem.j.449,497-506]，通过蛋白印迹(westernblot)分析来评估均在完全培养基和禁食培养基(即从培养基中部分移除营养物质)中温育的以上提及的细胞系(c1、c2、l1、l2、m1、a1、a2和a3)中的lc3-ii的水平。为了确定自噬流，已经抑制了溶酶体降解(用0.2mm亮抑蛋白酶肽(leupeptin)和20mmnh4cl)，如所描述的[fuertes等，2003biochem.j.375,75-86]，使得这种方式蓄积lc3-ii蛋白。使用抗lc3和抗肌动蛋白(用作负载对照)的抗体。

结果，研究1：

在用5μm的金属复合物(ii)处理或不处理的情况下，在细胞系c1和c2(健康个体)、l1、l2和m1(拉福拉病患者)中进行研究1。

在每种情况中使用完全培养基和使用禁食培养基进行研究。将营养物质从培养基中部分移除模仿了细胞禁食状态(禁食培养基)并且引起细胞激活自噬以从降解内部结构获得能量。如在图1中所示，对照成纤维细胞(细胞系c1、c2)、来自拉福拉病患者的成纤维细胞(在图1a中的细胞系l1、l2和m1以及在图1b中的细胞系l3和m1)在用浓度为5μm的金属复合物(ii)在6小时期间处理之后具有更高的lc3-ii蛋白水平。因此，结果表明在用金属复合物(ii)处理的健康细胞系和拉福拉病患者细胞系二者中的自噬的增加。

结果，研究2：

在不存在(标记为1)或存在1μm、5μm和10μm浓度(分别标记为2、3和4)的金属复合物ii的情况下测试在健康的或具有在laforin(l1和l2)和malin(m1)中的突变的人成纤维细胞(3349b和3348d)上的lc3-ii的水平。使用雷帕霉素(rapamycin)作为阳性对照(标记为5)。

如在图2中所示，在1、5和10μm浓度下的金属复合物(ii)当加入至培养基时改善了在laforin和malin中具有缺陷的人成纤维细胞上的自噬缺陷，其中lc3-ii的量表示自噬激活的水平。

1.2.自噬泡的数量的研究。

利用gfp-lc3荧光转染细胞的研究进行本测试，从而确定用金属复合物(ii)处理的细胞中的自噬的水平。在6小时期间用0.5μg的pegfp-lc3瞬时转染健康人成纤维细胞和来自拉福拉病患者的成纤维细胞。在转染之后大约24小时，在6小时期间用5μm金属复合物(ii)处理一部分细胞。在处理的***后90分钟期间，加入溶酶体抑制剂(0.2m亮抑蛋白酶肽+20mmnh4cl)。

如在图1c中所示，在人成纤维细胞中(在健康人成纤维细胞或呈现出拉福拉病的人成纤维细胞二者中)，金属复合物(ii)使自噬泡的数量增加，并且因此增加自噬。

实施例2：蛋白酶体糜蛋白酶样激活的研究

示出了在人真皮成纤维细胞中使用金属复合物(ii)的蛋白酶体糜蛋白酶样激活的体外研究。以相对于对照标准化的相对发光单位(relativeluminescenceunit，rlu)测量结果。图3b示出了当与对照未处理原代人真皮成纤维细胞相比时，用浓度为5μm的金属复合物(ii)处理以64.0±16.0％(p值＝0.0103)刺激蛋白酶体糜蛋白酶样活性。还使用2q进行了本研究(图3a)，2q为也包含三氮杂吡啶环蕃中心结构的mn(ii)复合物，但是其中在2q中的喹诺酮杂环通过2位与三氮杂吡啶环蕃中心结构键合，而不是如在本文中公开的金属复合物中通过4位与三氮杂吡啶环蕃中心结构键合。如在图3a中所示，所述化合物对蛋白酶体活性并未显示出任何显著影响。

下表还总结了用金属复合物(ii)进行的测试的结果：

这确认了仅其中喹诺酮部分通过4位与三氮杂吡啶环蕃中心结构连接的在本文中公开的金属复合物可用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

实施例3：秀丽隐杆线虫亨廷顿病模型中的响应激活。

进行研究以评估金属复合物(ii)的施用是否改善了秀丽隐杆线虫(c.elegans)亨廷顿病模型中的神经敏感性(轻微触摸敏感性)。

秀丽隐杆线虫利用神经元回路检测并且响应于多种机械刺激。这些刺激包括传递至身体的轻微触摸刺激、对身体中部的严苛触摸、对头部或尾部的严苛触摸、鼻触摸和肌理。

用于测试轻微触摸敏感性的***初且***常用的方法是用已经胶粘至牙签末端的眉毛轻触动物(图4)。

使用表达与机械感觉神经元聚集体中的tdtomato在框中融合的110cag的秀丽隐杆线虫和诱导的神经损害。图5a示出了显示在flp机械感觉神经元(圆圈示出)中的110q::tdtomato表达的秀丽隐杆线虫转基因蠕虫的头部的共聚焦图像。淡灰色的组织是针对转基因的标记物(即在咽部中表达的绿色荧光蛋白(gfp))。图5b示出了显示表达110q::tdtomato聚集体(圆圈示出)的flp神经元的具有细节的共聚焦图像。

在图5c中示出了秀丽隐杆线虫神经元损害，其中使用触摸测定对表达110q::tdtomato的三个独立品系进行测试，如以上对于图4描述的。如在图5c中看到的，当与野生型动物(标记为wt)的结果相比时，表达110q::tdtomato的所有三个测试品系均显示出神经元损害(作为显示出触摸响应的个体的％示出的较低的机械感受)。

图5d示出了金属复合物(ii)如何能够以剂量依赖性方式挽救归因于110q::tdtomato表达的神经元损害。使用未处理的动物(表达110q::tdtomato并且因此显示出神经元损害)进行测试作为对照c，并且将用2mm的二甲双胍处理的动物用作阳性对照。结果基于在图6中所示的三个实验重复。使用未处理的动物作为对照以及用浓度为2mm的二甲双胍处理的动物作为阳性对照，通过用5、10和20μm浓度的金属复合物(ii)处理动物(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)进行每个测试。

图7示出了相对于在测试剂量中不产生任何显著变化的化合物2q，金属复合物(ii)如何能够以剂量依赖性方式挽救归因于110q::tdtomato表达的神经元损害。使用未处理的动物(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)进行测试作为对照c。再次使用二甲双胍作为阳性对照。再次地，这些数据表明，仅其中喹诺酮部分通过4位与三氮杂吡啶环蕃中心结构连接的在本文中公开的金属复合物的选择可用于治疗与细胞内沉积物蓄积相关的疾病和/或与缺陷型自噬和/或缺陷型蛋白酶体活性相关的疾病。

***后，测试在使用金属复合物(ii)处理的情况下所示出的归因于110q::tdtomato表达的神经元损害的挽救是否由自噬的激活产生。为此，在存在和不存在氯喹(公知的自噬抑制剂)的情况下，在金属复合物(ii)的存在下将蠕虫秀丽隐杆线虫(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)温育。作为对照，还在存在和不存在氯喹但是不进行用金属复合物(ii)的处理的情况下将动物(表达显示出神经元损害的110q::tdtomato)温育。如图8所示，在两种化合物的存在下培养的动物不再被挽救，表明金属复合物ii的有益效果归因于自噬而不是其他可能的机制。

实施例4：式(i)的金属复合物的体内急性毒性

为了评价急性毒性，向分为4组、每组3只小鼠的总计12只小鼠体内施用金属复合物(ii)。雄性和雌性小鼠体重分别为24至30g和17至22g。向小鼠口服施用金属复合物(ii)以及磷酸盐缓冲液(pbs)或nacl0.9％。

在pbs中或在0.9％的nacl中，在口服施用的高达200mg/kg的剂量下，在测试的小鼠(雄性和雌性)中，急性毒性实验既没有显示出死亡，也没有显示出降低的自发活动。